Caracterización cultural y morfológica

Para cada aislado se preparó una suspensión de conidios de la que se tomó 0,1 mL y se sembró con espátula de Drygalski en medio agar papa dextrosa (PDA). Las placas se incubaron a 25 ± 2 ^oC. Transcurrido 72 h se transfirieron discos de 5 mm de diámetro al centro de placas de Petri con PDA, las que se incubaron bajo las mismas condiciones. A partir de las 72 h de incubación se revisó diariamente el crecimiento de los aislados hasta los 10 días y se anotaron las características culturales teniendo en cuenta el diámetro de la colonia, color, borde, textura y pigmentación del medio de cultivo. Se describió la morfología de los conidios y se midió la talla (largo x ancho) en microscopio de contraste de fase Carl Zeiss (40x y 100x). Se midieron 50 conidios por aislado y se consideraron los valores extremos y mínimos según los criterios taxonómicos citados por Rehner et al., 2005Rehner S.y Buckley E. 2005. A Beauveria phylogeny inferred from ITS andEF1-a sequences: evidence for cryptic diversification and links to Cordycepsteleomorphs. Mycologia. 97: 84-98.
, 2011Rehner S., Minnis A., Sung G., Luang-sard J., Devotto L. y Humber R. 2011. Phylogeny and systematics of the anamorphic, entomopathogenicgenus Beauveria. Mycologia. 103: 1055-1073.
).

Evaluación del crecimiento de los aislados de Beauveria spp. en diferentes medios de cultivo y temperaturas de incubación

Los aislados se sembraron en placas con medio de cultivo PDA y se incubaron a 25 ± 2 °C. Transcurridas 72 h se tomaron discos de 5 mm con un sacabocado y se transfirieron al centro de placas Petri de 9 cm de diámetro con los siguientes medios de cultivo:

¹ 0,4 g de KH₂PO₄; 1,4 g de Na₂HPO₄; 0,6 g de MgSO₄; 1,0 g de KCl; 0,7 g de NH₄NO₃; 10 g de glucosa, 15 g de agar-agar; 5 g de extracto de levadura; 1000 mL de agua destilada.

Se midió diariamente el diámetro de las colonias hasta los 10 días. Se realizaron cinco réplicas por aislado (Onofre et al., 2001).

Para evaluar el crecimiento a diferentes temperaturas se utilizó el procedimiento descrito anteriormente y se incubó a las temperaturas de 28, 30, 32 y 34 ^oC.

Se calculó el nivel de esporulación a partir del último día del crecimiento de la colonia. Se tomó un disco con un sacabocado de la zona más próxima al centro de la colonia. El disco se llevó a un tubo de ensayo con 5 mL de agua destilada estéril y Tween 80 al 0,1 % v/v y se agitó por 10 min. Se contó el número de conidios en cámara de Neubauer a 400x en microscopio de contraste de fase. Se halló el valor promedio y se calculó el número de conidios • mm^-2 (Pacolla-Meirelles y Azevedo,1990Paccola-Meirelles L. y Azevedo J. 1990. Variabilidae natural no fungo entomopatogénico Beauveria bassiana. Arq. Biol. Tecnol. 33(3):657-672.
).

Evaluación cualitativa de la producción de enzimas extracelulares

La detección de enzimas extracelulares proteasa, amilasa, lipasa, quitinasa y caseinasa se realizó según protocolo propuesto por Sanivada y Challa, 2014Sanivada S. y Challa M. 2014. Mycolytic effect of extracellular enzymes ofentomopathogenic fungi to Colletotrichum falcatum, red rot pathogen ofsugarcane. J. Biopest. 7: 33-37.
. La actividad enzimática se expresó como la relación entre el diámetro de la colonia y el diámetro del halo causado por la degradación del sustrato. La presencia de la actividad enzimática se constató a partir de valores de índice enzimático mayores a 1 (St. Leger et al., 1997St Leger R., Joshi L. y Roberts D. 1997. Adaptation of proteases, carbohydrases of saprophytic, phytopathogenic, and entomopathogenic fungi tothe requirements of their ecological niches. Microbiology. 143: 1983-1992.
).

Para cada enzima evaluada las placas de Petri con el medio de crecimiento específico se inocularon con discos de 5 mm de diámetro con micelio de los aislados, los que se incubaron a 25 ± 2 ^oC durante 10 días. Se utilizó como control negativo el crecimiento de los aislados en medio mínimo de crecimiento (0,003 % NaCl, 0,03 % MgS0₄, y 0,015 % de K₂HPO₄) con el 2 % de agar, sin el sustrato de la enzima a ensayar.

Determinación de la patogenicidad de los aislados de Beauveria spp. sobre Cylas formicarius

Se prepararon frascos Roux de 100 mL de capacidad con medio de crecimiento SDA, los que se inocularon con una suspensión de los aislados a ensayar. Los mismos se incubaron a 25 ± 2 ^oC hasta alcanzar la completa esporulación del cultivo aproximadamente 10 días. Transcurrido ese tiempo se realizó una suspensión de cada aislado a una concentración de 1 x 10⁶, 1 x 10⁷, 1 x 10⁸, 1 x 10⁹ conidios • mL^-1 ajustada por conteo en cámara de Neubauer.

Para cada dilución se utilizaron 50 adultos de C. formicarius, los que fueron previamente desinfectados con hipoclorito de sodio al 0,1 % durante 1 min. Posteriormente se enjuagaron en agua destilada estéril y se sumergieron de 30 a 60 s en las suspensiones fúngicas preparadas anteriormente. Se utilizó un tratamiento control con agua destilada estéril. Los insectos tratados se colocaron en una placa que contenía papel de filtro para absorber el exceso de humedad y se introdujeron en placas de Petri estériles con dieta natural a base de boniato. Las placas con los insectos se incubaron a temperatura ambiente.

Diariamente se cuantificaron los insectos vivos y muertos para calcular el porcentaje de mortalidad según la fórmula de Abbot. Los tiempos letales (TL) TL₅₀ y TL₉₀ se calcularon a partir de las ecuaciones de regresión Probit que expresan la relación entre el porcentaje de mortalidad y el tiempo. Se utilizó el paquete estadístico Statistica Version 8.0.

Al finalizar el bioensayo los insectos muertos se colocaron en cámara húmeda y se incubaron a 25 ± 2 ^oC de temperatura para confirmar si la muerte de los insectos fue provocada por los aislados de Beauveria spp.

Reproducción a escala piloto del aislado LBb-1234 por método bifásico

Se evaluó la reproducción del aislado LBb-1234 sobre sustrato sólido según el procedimiento descrito por Márquez et al., 2010Márquez M., Fernández-Larrea O., Jiménez J., Elósegui O., Gómez R., Carreras B., Laguardia E., Monzón S., Ayala J., Massó E., Veitía M., Borges G. y Baró Y. 2010.Formas de obtención de controladores biológicos microbianos para su uso en el sistema de producción agrícola del Minag: 34-35.
.

Para la obtención del inóculo se preparó medio líquido compuesto de levadura torula 30 g • L^-1 y azúcar 20 g • L^-1. Se esterilizó 20 min a 121 ^oC. Cada erlenmeyer se inoculó con 1 mL de la suspensión del aislado. Los erlenmeyers se colocaron en zaranda por 48-50 h a 180 r.p.m. y temperatura entre 25-27 ^oC. Transcurrido ese tiempo se ajustó la concentración de los inóculos a 5 x 10⁷ blastosporas • mL^-1 para inocular 20 mL en el sustrato sólido.

La reproducción sobre sustrato sólido se realizó en potes plásticos que contenían 150 g del sustrato cabecilla de arroz. Se emplearon 20 potes plásticos y un contenedor control sin inóculo del hongo. La producción se realizó en un cuarto de incubación con humedad ambiental menor al 80 %. Los potes inoculados se incubaron a 25-27 ^oC.

Para el control de calidad de la muestra final se determinó la concentración, pureza y la viabilidad, según protocolos descritos en la Norma Cubana NC 1016: 2014Norma cubana NC1016: 2014. Biotecnología agrícola. Métodos de ensayos para biopreparados de entomopatógenos. Oficina Nacional de Normalización.
.

Análisis estadísticos

Los datos obtenidos se procesaron mediante Análisis de Varianza de clasificación simple (ANOVA) con test de significación de Tukey al 5 %. En caso de no cumplirse los supuestos del ANOVA se realizó el test no paramétrico de Kruskal-Wallis y test de comparación Mann Whitney 2 a 2. Se utilizó el programa SPSS 15.0 para Windows, versión 15.0.1.

Caracterización cultural y morfológica

En la caracterización morfológica y cultural de los aislados estudiados se evidenció que después de 10 días de incubación, los mismos comparten características morfológicas similares. En todos se observó colonias de color blanco algodonosas que se tornan pulvurulentas con el desarrollo de los conidios; algunas difunden pigmento de color amarillo pálido a amarillo intenso en el medio de crecimiento. Los valores medios del diámetro de las colonias estuvo entre 2,0-3,5 cm (Tabla 2, Fig. 1). Los aislados estudiados presentaron conidios de morfología globosa a subglobosas.

De manera general, las características culturales y morfológicas permiten indicar que los aislados pertenecen a Beauveria bassiana, pero no posibilitan la identificación precisa de los mismos, y aunque estos caracteres han sido importantes para identificar la especie es imprescindible el empleo de otros métodos como los moleculares.

Resultados similares obtuvo Eloseguí et al. (2006)Elósegui O., Jiménez J., Car A. 2006. Aislamiento, identificación y caracterización morfométrica de aislados nativos de hongos mitospóricos con potencialidades para el control de especies de insectos plaga. Fitosanidad, 10(4): 265-267.
. Estos autores describieron las características más notables de aislados de Beauveria obtenidos de insectos micosados. El tamaño de los conidios estuvo en un rango de 1,0-2,5 μm, la morfología de globosos a subglobosos y algunos elipsoidales.

Por su parte, Rehner y Buckley (2005)Rehner S.y Buckley E. 2005. A Beauveria phylogeny inferred from ITS andEF1-a sequences: evidence for cryptic diversification and links to Cordycepsteleomorphs. Mycologia. 97: 84-98.
informan la forma de los conidios de 90 aislados de Beauveria estudiados, entre globosos, elipsoidales, cilíndricos y con forma de coma y el tamaño entre 1,6-7,1 μm. Estos autores lograron establecer grupos a partir del análisis morfológico de los aislados con características similares, en los que posteriormente se observó diversidad filogenética a partir del análisis molecular.

Diversos autores informan que Beauveria presenta pocos caracteres morfológicos que permiten su diferenciación a nivel taxonómico. Las características del crecimiento y la apariencia de las colonias son similares entre la mayoría de las especies del género, lo cual coincide con los resultados en este trabajo (Rehner et al., 2011Rehner S., Minnis A., Sung G., Luang-sard J., Devotto L. y Humber R. 2011. Phylogeny and systematics of the anamorphic, entomopathogenicgenus Beauveria. Mycologia. 103: 1055-1073.
; Sentil Kumar, 2016Kumar C., Jacob T., Devasahayam S. y D’Silva S. 2016. Characterization and virulence of Beauveria bassiana associated with auger beetle (Sinoxylonanale) infesting allspice (Pimenta dioica). J. Invertebr. Pathol. 139:67-73.
).

Respecto a las colonias, generalmente se observan blancas a ligeramente amarillas, con una textura lanosa o algodonosa que frecuentemente se vuelve harinosa con la acumulación de los conidios en la superficie de los cultivos. Se exceptúa B. malawiensis con colonias que son ligeras o intensamente rosadas, y B. sungii, que son amarillo intensas. La única especie caracterizada sobre la base de la morfología de los conidios es B. vermiconia, la cual produce conidios cortos en forma de coma u hoz. Por otra parte, la forma de los conidios en otras especies de Beauveria son más o menos globosos a subglobosos, elipsoidales, oblongos o cilíndricos. Las especies dentro de cada una de estas categorías se solapan en el tamaño y son difíciles de diferenciar (Rehner et al., 2011Rehner S., Minnis A., Sung G., Luang-sard J., Devotto L. y Humber R. 2011. Phylogeny and systematics of the anamorphic, entomopathogenicgenus Beauveria. Mycologia. 103: 1055-1073.
; Imoulan et al., 2017Imoulan A., Hussain M., Kirk P., El Mezianee A. y Yi Jian Y. 2017. Entomopathogenic fungus Beauveria: Host specificity, ecology and significance of morpho-molecular characterization in accurate taxonomic classification. Journal of Asia-Pacific Entomology, 20: 1204-1212.
).

Estudios realizados décadas atrás han basado la caracterización de este hongo por la descripción y medidas de estructuras de interés taxonómico (Rehner y Buckley, 2005Rehner S.y Buckley E. 2005. A Beauveria phylogeny inferred from ITS andEF1-a sequences: evidence for cryptic diversification and links to Cordycepsteleomorphs. Mycologia. 97: 84-98.
; Rehner et al., 2011Rehner S., Minnis A., Sung G., Luang-sard J., Devotto L. y Humber R. 2011. Phylogeny and systematics of the anamorphic, entomopathogenicgenus Beauveria. Mycologia. 103: 1055-1073.
), sus características fisiológicas (Liu et al., 2003Liu H., Skinner M., Bridge M. y Parker B. 2003. Characterization of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae isolates for management of tarnished plant bug, Lygus lineolaris (Hemiptera: Miridae). J. Invertebr. Pathol. 82: 139-147.
) y patogénicas (Wright et al., 2008) y los resultados de estudios isoenzimáticos (Fernandes et al., 2012Fernández E., Valerio H., Feltrin T., Van Der Sand S. 2012. Variability in the productionof extracellular enzimes by entomopatogenic fungi grown on different substrates. Brazilian Journal of Microbiology, 827-833.
). Sin embargo, se ha visto que son insuficientes para investigar especies como B. bassiana (Rehner y Buckley, 2005Rehner S.y Buckley E. 2005. A Beauveria phylogeny inferred from ITS andEF1-a sequences: evidence for cryptic diversification and links to Cordycepsteleomorphs. Mycologia. 97: 84-98.
; Rehner et al., 2011Rehner S., Minnis A., Sung G., Luang-sard J., Devotto L. y Humber R. 2011. Phylogeny and systematics of the anamorphic, entomopathogenicgenus Beauveria. Mycologia. 103: 1055-1073.
). Por tal motivo, en la actualidad para la taxonomía de las especies del género se emplea el análisis de las secuencias parciales de la región nuclear intergénica Bloc, y de tres genes que codifican proteínas nucleares como TEF1, RPB1 y RPB2 (Imoulan et al., 2016Imoulan A., Hai-Jun W., Wei-Lai L., Yi L., Bin L., Rei Y., Wen-Jing W. Xiao-Liang W., Paul M. y Yi-Jian Y. 2016. Beauveria medogensi ssp. nov, a new fungus of the entomopathogenic genus from China. J. Invertebr. Pathol. 139: 74-81.
; Khonasabit et al., 2020Khonsanit A., Luangsa-ard J. Thanakitpipattana D., Noisripoom W., Chaitika T. & Kobmoo N. 2020. Cryptic diversity of the genus Beauveria with a new species from Thailand. Mycol Progress 19:291-315.
).

En general, una de las principales desventajas de la caracterización morfológica es que las características a medir son limitadas en número, por lo cual la discriminación entre aislamientos es difícil. Sin embargo, algunas de estas características como la virulencia o el nivel de esporulación son variables críticas que medir en los sistemas de producción y de su estabilidad depende en gran parte el éxito del producto (Jenkins y Grzywacz, 2003). De ahí el que tan alto número de estudios se enfoquen en determinar la estabilidad fenotípica con respecto a estas variables en los aislados potencialmente útiles para desarrollarse como bioplaguicidas.

Evaluación del crecimiento de los aislados de Beauveria spp. en diferentes medios de cultivo

La Tabla 3 muestra el crecimiento de los aislados de Beauveria en los diferentes medios de cultivo ensayados. Los medios más favorables para el crecimiento fueron MEA, MC y SDA.

En el aislado LBb-1234 se encontraron diferencias significativas en el diámetro de crecimiento de las colonias en todos los medios de cultivo, siendo MEA donde se obtuvo el mayor valor de crecimiento de la colonia, y en agar Czapek el menor valor; comportamiento similar se obtuvo en el aislado LBb-Cp2. En este aislado no se encontró diferencias entre agar Czapek y SDA, como tampoco entre MC y PDA.

El aislado LBb-IIIf tuvo su mayor valor de crecimiento en MC, difiriendo significativamente del resto de los medios de cultivos. Este aislado, al igual que LBb-1234, obtuvo el menor crecimiento en el medio de cultivo CDA.

El aislado LBb-76 no mostró diferencias significativas de crecimiento en los medios MEA y MC. En este último alcanzó su mayor crecimiento. Sin embargo, su menor diámetro fue en SDA sin grandes diferencias con CDA, en el que obtuvo un comportamiento similar con PDA.

La Fig. 2 muestra la morfología de las colonias de los aislados de Beauveria en los medios de crecimiento.

Nótese la difusión de pigmento amarillo intenso del aislado LBb-Cp2 en el medio Czapek (2B).

La composición y concentración de nutrientes presentes en cada medio de cultivo: fuentes de carbono, nitrógeno, sales minerales y la relación carbono/nitrógeno intervienen notablemente en la germinación, crecimiento de las hifas y en la emergencia del tubo germinativo.

Estas características influyen para que un mismo aislado presente características culturales diferentes (Chan-Cupul et al., 2010Chan-Cupul W., Ruiz E., Cristóbal J., Pérez A., Mungía R. y Lara R. 2010. Desarrollo in vitro de cuatro cepas nativas de Paecilomyces fumosoro seus y su patogenicidad en estados inmaduros de mosquita blanca. Agrociencia, 44(5): 587-597.
; Obando et al., 2013Obando J., Bustillo A., Castro U., Mesa N. 2013. Selección de cepas de Metarhiziuman isopliae para el control de Aeneolamia varia (Hemiptera: Cercopidae). Revista Colombiana de Entomología. 39(1): 26-33.
). Onofre et al. (2001) plantearon que existen factores promotores del crecimiento, los cuales están presentes en los diferentes medios de cultivo empleados. Estos factores pueden ser los responsables del mejor comportamiento y crecimiento de las colonias en medios con un alto contenido de nutrientes.

Con relación a la concentración de conidios, se observó diferencias significativas en los medios de cultivo evaluados (Tabla 4).

Los medios de cultivos que indicaron un mayor valor de concentración de conidios fueron SDA, MC y MEA en los aislados LBb-1234, LBb-76 y LBb-Cp2; sin embargo, en LBb-IIIf el mayor valor de concentración se alcanzó en el medio Czapeck, el cual representó un medio de baja concentración de conidios para los demás aislados.

El aislado LBb-1234 fue el de mayor producción de conidios entre todos los aislados, y LBb-IIIf el de menor concentración con respecto a los demás. Este aislado se caracteriza por un crecimiento en diámetro de la colonia superior al resto, sin embargo, produce abundante micelio y escasa producción de conidios.

La esporulación de cada aislado fue variable dependiendo del sustrato, lo cual presenta utilidad práctica, pues permite conocer los medios de cultivo que garanticen una mayor producción de conidios para cada aislado en particular, parámetro importante a considerar en el desarrollo de un microorganismo como bioplaguicida.

En los hongos los factores nutricionales más importantes para la esporulación son la concentración de nutrientes del medio de cultivo, fuente de carbono y nitrógeno, así como la relación carbono/nitrógeno (Onofre et al., 2001; Zimmermann, 2007Zimmermann G. 2007. Review on safety of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae. Biocontrol Science and Technology. 17 (9): 879-920.
).

Evaluación del crecimiento de los aislados a diferentes temperaturas

La temperatura es un factor ambiental relevante para la eficacia de agentes microbianos fúngicos por incidir en su crecimiento vegetativo y persistencia en el campo.

Al respecto, Carrillo-Rayas y Blanco-Labra (2009)Carrillo-Rayas M. y Blanco-Labra A. 2009. Potencial y algunos mecanismos de acción de los hongos entomopatógenos para el control de insectos plaga. Acta Universitaria, 19 (2): 40-49.
plantearon que este factor debe ser considerado como un punto de partida para la selección de aislados con potencial para el control biológico.

La Fig. 3 muestra los resultados del crecimiento de los aislados a las temperaturas ensayadas.

Las temperaturas en las cuales los aislados indicaron un mayor crecimiento fueron 28 y 30 ^oC. A 34 ^oC no hubo crecimiento en ninguno de los casos. El aislado LBb-IIIf alcanzó mayor crecimiento micelial en todas las temperaturas, al contrario de LBb-1234, que fue el de menor crecimiento. En el aislado LBb-Cp2 se encontró diferencias significativas en todas las temperaturas ensayadas y fue el segundo mejor en cuanto al crecimiento.

En la Fig. 4 se muestran las características del aislado LBb-1234 a las temperaturas ensayadas. A 28 ^oC y 30 ^oC este aislado presenta colonias de color blanco, algodonosas y con abundante crecimiento micelial. Alrededor de los 10 días de crecimiento se observa esporulación con formación de anillos concéntricos y producción de exudados. A 32 ^oC las características son similares, pero el diámetro de la colonia es menor y hay retardo en la maduración de los conidios. A 34 ^oC no se observa crecimiento.

Estudios previos realizados por Eloseguí et al. (2006)Elósegui O., Jiménez J., Car A. 2006. Aislamiento, identificación y caracterización morfométrica de aislados nativos de hongos mitospóricos con potencialidades para el control de especies de insectos plaga. Fitosanidad, 10(4): 265-267.
informaron temperaturas óptimas para estos aislados entre 25 y 27 ^oC. Kumar et al. (2016)Kumar C., Jacob T., Devasahayam S. y D’Silva S. 2016. Characterization and virulence of Beauveria bassiana associated with auger beetle (Sinoxylonanale) infesting allspice (Pimenta dioica). J. Invertebr. Pathol. 139:67-73.
obtuvieron los valores mayores del crecimiento de la colonia a 28 y 32 ^oC. Sin embargo, a las temperaturas de 20 y 27 ^oC el crecimiento de las colonias de Beauveria fue menor. Estos mismos autores no observaron crecimiento a 35 ^oC para ninguna de las cepas evaluadas. También Benz et al. (2015)Benz, G. 2015. Environment, In: Epizootiology of Insect Diseases. J. R.Fuuxa y Y. Tanada. (Eds.) Wiley & Sons, New York: 177-214.
encontraron que en general la germinación y el crecimiento puede ocurrir entre 5-35 ^oC, pero la temperatura óptima se encuentra entre 20-30 ^oC.

Con respecto al nivel de esporulación, a 28 ^oC se obtuvieron los mayores valores de concentración de conidios, con diferencias significativas respecto a 30 ^oC y 32 ^oC. De manera general los valores de este parámetro oscilaron entre 1-6 • 10⁷ conidios • mm^-2. El aislado LBb-1234 fue el que alcanzó mayor concentración (Tabla 5).

De acuerdo con Samson et al. (1988), los requerimientos McCoy et al. (1988) y Van Driesche y Bellows (1996), las de temperatura varían con la especie del hongo, y para temperaturas óptimas para el desarrollo, patogenicidad y los que se hallan en zonas tropicales y subtropicales la sobrevivencia de los hongos, incluyendo a los hifomicetos temperatura óptima oscila alrededor de los 25 ^oC. Según entomopatógenos, fluctúan entre 20 y 30 ^oC.

Evaluación cualitativa de la producción de enzimas extracelulares

Los hongos entomopatógenos tienen la capacidad de producir disímiles compuestos extracelulares, algunos de los cuales son importantes biológicamente por provocar reacciones en otros organismos. Estos compuestos incluyen diferentes tipos de enzimas con funciones determinadas en la patogenicidad. Básicamente las esporas germinadas tienen la habilidad de penetrar directamente la cutícula del insecto por hidrólisis enzimática (Fernandes et al., 2012Fernández E., Valerio H., Feltrin T., Van Der Sand S. 2012. Variability in the productionof extracellular enzimes by entomopatogenic fungi grown on different substrates. Brazilian Journal of Microbiology, 827-833.
).

La Tabla 6 muestra los valores promedios del índice de actividad enzimática evaluado para algunas enzimas hidrolíticas.

La presencia de actividad proteasa, lipasa y caseinasa fue positiva para todos los aislados. En el caso de la enzima proteasa, el índice de actividad enzimática fue superior a 1; y en aquellos aislados que no se observó la formación de un halo definido, hubo abundante crecimiento micelial y posterior esporulación, teniendo en cuenta el crecimiento de los aislados en cada medio con el observado en el medio mínimo, no suplementado con el sustrato de la enzima.

En la producción de la enzima quitinasa se apreció un ligero crecimiento micelial, esporulación alrededor del ponchete y halos de hidrólisis en los aislados LBb-Cp2 y LBb-IIIf, no siendo así para LBb-76 y LBb-1234 en las que no se apreció crecimiento alguno.

Estudios realizados por Fernandes et al. (2012)Fernández E., Valerio H., Feltrin T., Van Der Sand S. 2012. Variability in the productionof extracellular enzimes by entomopatogenic fungi grown on different substrates. Brazilian Journal of Microbiology, 827-833.
informaron la presencia de actividad lipasa, proteasa y caseinasa en varias cepas de Beauveria, Metarhizium y Paecilomyces, revelando la importancia de estas enzimas para la patogenicidad de los hongos entomopatógenos. Los valores de índice de actividad enzimática encontrados por estos autores estuvieron en un rango de 1-2,5, y donde no se observó un halo de hidrólisis definido hubo abundante crecimiento micelial. Estos resultados coinciden con los obtenidos en este estudio.

La actividad lipasa se apreció en todas las cepas estudiadas por St. Leger et al. (1986), los que indicaron que esta enzima se produce en elevadas cantidades por las cepas de Beauveria y Metarhizium, demostrando la importancia de esta enzima en la virulencia de los entomopatógenos hacia los insectos susceptibles.

En relación con la produccion de enzima amilasa, en ningún aislado se vizualizó la producción de la misma. No se observó halos de hidrólisis, y el crecimiento micelial de los aislados fue escaso y similar al del medio mínimo. Estos resultados coinciden con los descritos por Murad et al. (2006)Murad A., Laumann R. Lima T., Sarmento R., Noronha E., RochaT., Valadares-Inglis M. y Franco O. 2006. Screening of entomopathogenic Metarhiziuman isopliae isolates and proteomic analysis of secretion synthesized in response to cowpea weevil (Calloso bruchus maculatus) exoskeleton. Comp. Biochem. Physiol. 142(3): 365-367.
, los que concluyen que esta enzima no es importante en el proceso patogénico porque la cutícula de los insectos no presenta almidón en su composición.

En la Fig. 5 se pueden apreciar los resultados de la evaluación cualitativa de las enzimas hidrolíticas ensayadas.

Los hongos entomopatógenos producen un gran número de enzimas que son de utilidad para su acción sobre el hospedero, pues le permiten convertir los tejidos de los insectos en nutrientes para su crecimiento. Las enzimas son importantes en el proceso patogénico, porque permiten al patógeno coexistir con los procesos metabólicos asociados con los estados de enfermedad del hospedero. Las cutículas son muy poco utilizadas por la mayoría de los hongos, pero es indispensable su penetración para la completa invasión. Por tal motivo han desarrollado también un poderoso sistema enzimático con este fin, dentro del que se encuentra un amplio espectro de proteasas muy activas, necesarias además para la penetración de la epicutícula hidrofóbica. La variación en la virulencia se puede relacionar con la producción y actividad enzimática durante la penetración en la cutícula del hospedero (Saranraj y Jayaprakash, 2017Saranraj P. y Jayaprakash A. 2017. Agrobeneficial entomopathogenic fungi - Beauveria bassiana: A review. Indo - Asian Journal of Multidisciplinary Research (IAJMR). 3 (2): 1051- 1087DOI: 10.22192/iajmr.2017.3.2.4
).

Determinación de la patogenicidad de los aislados de Beauveria spp. sobre Cylas formicarius

La evaluación de la patogenicidad de los aislados hacia adultos de C. formicarius mostró la susceptibilidad del insecto, pudiéndose observar mortalidad en los individuos tratados con diferentes concentraciones del hongo.

A la concentración de 1 • 10⁹ conidios • mL^-1 todos los aislados lograron 100 %. El aislado LBb-1234 exhibió 100 % de mortalidad en todas las concentraciones ensayadas, en contraste con el resto, en las que se alcanzó valores entre un 34-96 % a las diferentes concentraciones, a los 15 días posteriores al tratamiento. El aislado LBb-76 fue el menos patogénico hacia C. formicarius con una mortalidad del 34 % a la concentración de 10⁶ conidios • mL^-1.

En la Fig. 6 se observa una cámara húmeda con la emersión del hongo en la superficie, lo que indica la muerte de C. formicarius por la acción patogénica de los aislados de Beauveria evaluados.

Durante el bioensayo la mortalidad de los insectos comenzó a registrarse a partir del tercer día de iniciado el tratamiento. Los tiempos letales TL₅₀^{y TL}₉₀ más bajos se registraron para el aislado LBb-1234 con 4,3 y 9,4 días, respectivamente, a una concentración de 1 • 10⁸ conidios • mL^-1, lo que indica la alta virulencia de este aislado. La Tabla 7 refleja la susceptibilidad del insecto a diferentes concentraciones de los aislados.

Resultados similares obtuvo Reddy et al. (2014)Reddy G., Zhao Z. y Humber R. 2014. Laboratory and field efficacy of entomopathogenic fungi for the management of sweet potato weevil, Cylasformicarius (Coleoptera: Brentidae). J. Invertebr. Pathol. 122: 10-15.
al evaluar una cepa de B. bassiana y Metarhizium bruneum. Estos autores alcanzaron el 100 % de mortalidad contra este insecto a partir de 168-192 h posteriores al tratamiento. De manera análoga, otros estudios evaluaron la patogenicidad de cepas de M. anisopliae, P. lilacinus y B. bassiana, siendo esta última moderadamente virulenta a C. formicarius a concentraciones de 1 x 10⁷ conidios • mL^-1 y provocando el 50 % de mortalidad a los cuatro días posteriores al tratamiento (Hlerema y Eiasu, 2017). También Ondiaka et al. (2008)Ondiaka S., Maniana N., NyamasyG., Nderitu J., Onofre S. Miniuk C., Monteiro N. y Azevedo J. 2001. Growth and sporulation of Metarhizium flavoviride var. flavoviride on culture media and lighting regimens. Scientia Agricola. 58 (3): 613-616.
determinaron el efecto de B. bassiana y M. anisopliae en adultos de Cylas puncticollis; ambos hongos provocaron entre el 62,5 % y 89,2 % de mortalidad contra esta especie.

La capacidad de esporulación del hongo sobre su hospedero es fundamental para la diseminación de la enfermedad en condiciones de campo, lo que permite la reinfección a partir de los insectos muertos parasitados. El período requerido para matar al insecto es variable, dependiendo de la cantidad de esporas que se depositen sobre el mismo, la temperatura, la especie, el tamaño y la edad del insecto (Saranraj y Jayaprakash, 2017Saranraj P. y Jayaprakash A. 2017. Agrobeneficial entomopathogenic fungi - Beauveria bassiana: A review. Indo - Asian Journal of Multidisciplinary Research (IAJMR). 3 (2): 1051- 1087DOI: 10.22192/iajmr.2017.3.2.4
).

Otro aspecto importante para considerar son las relaciones entre la patogenicidad de los aislados y su hospedante de origen. En este caso los aislados estudiados provienen de H. hampei, lo que puede influir en la susceptibilidad de C. formicarius. Según Zimmermman (2007)Zimmermann G. 2007. Review on safety of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae. Biocontrol Science and Technology. 17 (9): 879-920.
, los hongos entomopatógenos no aparecen estrechamente ligados a una especie, género o grupo de hospedante homogéneo taxonómicamente. Este aspecto ha sido discutido por varios autores, los que señalan que una cepa puede ser más o menos virulenta contra otros insectos no huésped (Imoulan et al., 2017Imoulan A., Hussain M., Kirk P., El Mezianee A. y Yi Jian Y. 2017. Entomopathogenic fungus Beauveria: Host specificity, ecology and significance of morpho-molecular characterization in accurate taxonomic classification. Journal of Asia-Pacific Entomology, 20: 1204-1212.
).

Algunos autores refieren que el criterio primario para la selección de un aislado como mico-insecticida se basa en su virulencia determinada por ensayos de laboratorio (Reay et al., 2008). Sin embargo, Ibarra-Cortés et al. (2013)Ibarra-Cortés K., Guzmán F., González H., Suárez E. y Baverstock, J. 2013. Selection of a fungal isolate for the controlof the pink hibiscus mealybug Maconelli coccus hirsutus. Pest Manag. Sci. 69: 874-882.
y Senthil Kumar et al. (2015)Senthil Kumar C., Jacob T., Devasahayam S., D’Silva S., Jinsha J. y Rajna S. 2015. Occurrence and characterization of a tetrahedralnucleopolyhedrovirus from Spilarctia oblique (Walker). J. Invertebr. Pathol. 132: 135-141.
enfatizan no solo en la virulencia, sino también en su capacidad de adaptación a las condiciones abióticas en las que vive la plaga.

En este análisis se observó diferencias en la patogenicidad de los cuatro aislados estudiados, lo que se manifestó en el porciento de mortalidad y los tiempos letales. Aunque estos ensayos se realizan en condiciones óptimas, lo cual no refleja las condiciones naturales encontradas en el campo, son de utilidad para la selección de cepas promisorias.

La variación en la virulencia se atribuye a varios factores, entre los que se incluyen el origen geográfico del aislado, la fuente del aislamiento, la variabilidad genética, los subcultivos en medio artificial, la susceptibilidad de hospedantes y las diferencias en la secreción de enzimas hidrolíticas (Perinotto et al., 2014Perinotto W., Golo P., Coutinho C., Sa F., Santi L., Beys da Silva W., Jungues A., Vainteins M., Schrank A., Salles C. y Bittencourt V. 2014. Enzymatic activities and effects of mycovirus infection on the virulence of Metarhiziuman isopliae in Rhipicephalus microplus. Veterinary Parasitology. 203: 189-196.
).

Reproducción a escala piloto del aislado LBb-1234 por método bifásico

La producción a gran escala de cepas de Beauveria y otros hongos entomopatógenos mediante fermentación sobre sustrato sólido sigue siendo un método eficiente para el desarrollo de bioplaguicidas y su utilización en las estrategias de control biológico.

La obtención de conidios aéreos sobre un sustrato sólido, utilizando principalmente granos de cereales como el arroz y que involucra el crecimiento del hongo en dos fases, de líquido a sólido o de sólido a sólido, es un proceso relativamente fácil, aunque laborioso, pero muy utilizado como producción artesanal de baja tecnología (Mascarin y Jaronski, 2016Mascarin G. y Jaronski S. 2016. The production and uses of Beauveria bassiana as a microbial insecticide. World J Microbiol Biotechnol. 32,177. DOI:10.1007/s11274-016-2131-3.
).

La selección del aislado LBb-1234 para evaluar su reproducción sobre el sustrato cabecilla de arroz tuvo en cuenta su elevada patogenicidad sobre C. formicarius, así como los niveles de concentración de conidios obtenidos en los diferentes ensayos.

La Tabla 8 muestra los valores de concentración y viabilidad del cultivo madre del aislado LBb-1234 para preparar el inóculo y la concentración de blastosporas obtenida transcurridas 48 h de agitación en zaranda orbital.

El cultivo original del hongo desde el cual se inició el lote de producción y el inóculo estaban puros, sin presencia de otros microorganismos contaminantes.

El proceso de producción hasta lograr la esporulación del hongo sobre el sustrato y alcanzar la concentración deseada duró 11 días, y el proceso de secado cuatro. La Fig. 7 muestra el recipiente utilizado en la reproducción del hongo con el sustrato cabecilla de arroz colonizado por los conidios del aislado LBb-1234, previo al proceso de secado.

Una vez concluido el secado del producto, se analizó la calidad del mismo, comprobándose que la reproducción del aislado fue apropiada y cumplió los requisitos deseados para este tipo de tecnología.

La producción obtenida se envasó en bolsas de polipropileno y se guardaron a 4 ^oC para ensayos posteriores de patogenicidad en condiciones de campo.

La Tabla 9 refleja los datos obtenidos del control de la calidad del producto una vez concluido el proceso de producción.

En la evaluación de la pureza del producto final no se observó la presencia de otros microorganismos. Las UFC • g^-1 correspondieron únicamente con colonias de Beauveria.

Los parámetros de calidad evaluados en el producto final están dentro de los valores permisibles de la Norma Cubana NC 1016: 2014Norma cubana NC1016: 2014. Biotecnología agrícola. Métodos de ensayos para biopreparados de entomopatógenos. Oficina Nacional de Normalización.
para biopreparados de entomopatógenos, que establece los siguientes indicadores:

Aunque solo se produjo y evaluó un lote de producción en el que se obtuvo 2767 g del producto de Beauveria, se comprobó que el aislado LBb-1234 se reproduce bien sobre este sustrato y con una elevada concentración de unidades infectivas.

Resultados sobre este tipo de producciones en diferentes países documentan que la fermentación sobre sustrato sólido es el método de producción más utilizado y con el cual se obtienen concentraciones en el orden de 10⁹ conidios • g^-1, principalmente de los entomopatógenos Beauveria y Metarhizium. Algunos países como Rusia producen anualmente 22 t de B. bassiana, logrando concentraciones de alrededor de 6,9 x 10⁹ conidios • g^-1 (Mascarin y Jaronski, 2016Mascarin G. y Jaronski S. 2016. The production and uses of Beauveria bassiana as a microbial insecticide. World J Microbiol Biotechnol. 32,177. DOI:10.1007/s11274-016-2131-3.
). Por su parte, Li et al. (2010)Li Z., Alves S., Roberts D., Fan M., Delalibera I., Tang J., Lopes R., Faria M. y Rangel D. 2010. Biological control of insects in Brazil and China: history, current programs and reasons for their successes using entomopathogenic fungi. Biocontrol Sci Technol. 20: 117-136.
informan que en Brasil este método es el principal sistema de producción de conidios, donde se produce Beauveria sobre sustrato de arroz por este método, logrando aproximadamente 10 t de conidios puros. Este producto se aplica en plantaciones de café y eucalipto para el control de diferentes plagas como thrips, mosca blanca, áfidos y saltahojas.

Debido a los efectos desfavorables del cambio climático y al proceso continuo de diversificación agrícola, se están produciendo cambios importantes en las manifestaciones de las plagas, así como en la eficacia y persistencia de los productos en el campo. Por tal motivo se hace necesario seleccionar cepas más tolerantes y adaptadas a los ecosistemas actuales. La selección de nuevos aislados de Beauveria permitirá garantizar nuevos agentes de biocontrol contra determinadas plagas, remplazar una cepa cuando se detecten problemas productivos y la posibilidad de emplear cepas nativas o mejor adaptadas a las condiciones de determinada región, para garantizar un control biológico más eficiente.

En la presente investigación las diferencias en las características estudiadas, así como la poca variabilidad observada en algunos caracteres como la morfometría de los conidios, demuestra la importancia del empleo de métodos morfológicos, fisiológicos, bioquímicos y patogénicos para la selección de cepas promisorias como agentes de control biológicos. Por otro lado, aunque las metodologías de reproducción en sustratos económicos para la obtención de abundantes unidades infectivas son conocidas y poco complejas, la evaluación de cada aislado es fundamental. Esto es elemental para el conocimiento básico de las cepas, el escalado y su posterior uso y aplicación, y el desarrollo de bioproductos con un alto impacto en el control de plagas agrícolas.